Script III RT MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑
Script III RT MasterMix為一管式逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液，含有逆轉(zhuǎn)錄所需的所有試劑：Script III Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、OligodT Primer、dNTP Mixture、RT Buffer。Script III RT MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑
Script III RT MasterMix
( Perfect for qPCR )
Script III RT MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑
目錄號(hào):71518
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71518-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71518-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x RT MasterMix | 200 μl | 400 μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 12 個(gè)月。
產(chǎn)品簡介
Script III RT MasterMix為一管式逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液，含有逆轉(zhuǎn)錄所需的所有試劑：Script III Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、OligodT Primer、dNTP Mixture、RT Buffer。
只需加入RNA模板和RNase-Free H2O，15分鐘即可完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 操作方便快捷，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物兼容染料法和探針法qPCR，用于檢測(cè)高拷貝或者低拷貝基因。
注意事項(xiàng)
1． 避免RNase污染。
2． 為保證反轉(zhuǎn)錄成功，建議使用高質(zhì)量的RNA樣品。
3． 5x RT MasterMix含有甘油比較粘稠，容易吸附在管壁和吸頭外，導(dǎo)致?lián)p失，使用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后取用。5x RT MasterMix包含的酶過量，即使每次分別按照3.8μl使用，也不影響使用效果。
4． 20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系建議加入不超過1μg的Total RNA。如果目的基因的表達(dá)量非常低，最多加入5 μg Total RNA，否則，RNA量過高，可能會(huì)超出后續(xù)qPCR的線性范圍。
5． 本產(chǎn)品適用于包含Ploy (A)結(jié)構(gòu)的真核生物mRNA和不包含Ploy (A)結(jié)構(gòu)的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不適用于miRNA等小RNA模板。
6． 如果模板具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，推薦使用變性步驟，即在操作步驟之前，將模板RNA在65℃孵育5 min后迅速轉(zhuǎn)移到冰上，再加RNA模板和RNase free H2O，混勻，50°C孵育15 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)
重要提示：操作前，請(qǐng)將各組分輕彈混勻，點(diǎn)甩離心后置冰上備用。
1． 反應(yīng)體系的配制
于冰上，在PCR管中，加入以下組分：
Components | Volume |
Total RNA / mRNA | 50ng ~ 1μg / 5ng ~ 100ng |
5x RT MasterMix | 4 μl |
RNase-free H2O | To 20 μl |
2． 輕柔吸打混勻，42℃孵育15 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3． 85°C加熱5 sec，終止反應(yīng)。
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，或保存于-20°C，并在半年內(nèi)使用；長期存放，請(qǐng)分裝后存于-70°C。
qPCR
建議取1~2μl cDNA產(chǎn)物原液作為20μl qPCR反應(yīng)體系的模板。
如果基因表達(dá)量比較高，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)稀釋cDNA模板后使用。
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