pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理
pBLUE-T Simple Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體。這種載體是由pBlueScript II SK(+)質(zhì)粒改建而成，和傳統(tǒng)T載體ECOR V切開后加T方法不同pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理
pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒
pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理
目錄號：42119
試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：
試劑盒組成 | 20次 (42119-20) | 60次 (42119-60) |
pBLUE-T Simple Vector(30ng/ml) | 20ml | 60ml |
1000bp Control（30ng/ml） | 5ml | 5ml |
10 ′ PEG Enhancer | 50ml | 150ml |
10 x Ligation Buffer | 40ml | 120ml |
2 ′Quick Ligation Buffer | 100ml | 300ml |
T4 DNA ligase, 5U/ml | 20ml | 60ml |
－20℃儲存，6個月內(nèi)不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹：
pBLUE-T Simple Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體。這種載體是由pBlueScript II SK(+)質(zhì)粒改建而成，和傳統(tǒng)T載體ECOR V切開后加T方法不同，pSURE-T Simple 通過改造pBlueScript II SK(+)，在原pBlueScript II SK(+)多克隆位點引入 Xcm I酶切后使其原多克隆位點兩側(cè)的3’末端直接產(chǎn)生未配對的T堿基，因此有更高的重組效率。同時它消除了pBlueScript II SK(+)載體上的多克隆酶切位點，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。此時如果使用PCR擴增引物導入的酶切位點進行DNA酶切時，酶切反應將不會受到T載體上其它多克隆酶切位點上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。此外，本公司載體連接體系還有背景低（藍斑小于10%），重組率高（白斑中超過90%有插入片段），可快速連接等特點。本說明書末列出了pBLUE-T Simple 載體相關的技術資料，其全序列可參照pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆酶切位點處序列稍有不同。
測序推薦采用M13通用測序引物和T3啟動子引物（見后面圖譜）
操作步驟：
1.連接反應的準備
PCR產(chǎn)物是否要進行純化取決于擴增產(chǎn)物的質(zhì)量。如果PCR產(chǎn)物非常干凈，不經(jīng)純化就可直接進行連接反應。但如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則必須進行純化，模板質(zhì)粒有可能也形成白斑。PCR產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離。本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進行回收。
Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物，其末端都帶有一個突出的3’ -A。 具有3’ -A末端的PCR產(chǎn)物可以直接用pBLUE-T Simple 載體進行克隆連接。具有3’®5’外切酶活性的DNA聚合酶（高保真酶）擴增的PCR產(chǎn)物是平末端，要對這種平末端PCR產(chǎn)物進行克隆，應先進行3’--端加A工作。
2. 常規(guī)連接反應：
1) 在一個標準的10 ml連接反應體系中，加入1 ml 30ng pBLUE-T Simple載體、X ml PCR產(chǎn)物(在通常狀況下，沒有必要對PCR產(chǎn)物進行精確定量，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1就可以得到良好結(jié)果，推薦3:1)、1ml 10′ligation Buffer和0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的T4 DNA Ligase，其余用水補足。反應按以下體系進行：
1ml | 10′Ligation Buffer (用前充分融解混勻) |
1ml | 10′ PEG Enhancer |
1ml | pBLUE-T Simple Vector |
Xml | 純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control |
Yml | 無菌水 |
0.5-1ml (5 Weiss Units/ml) | T4 DNA Ligase |
Final Volume | 10ml |
一般最后加入T4 DNA Ligase。
2) 16℃連接過夜（一般可在PCR儀器完成）。
通常推薦16℃連接過夜（10ml體系標準連接酶量為2.5 Weiss Units即可），可以得到最多的轉(zhuǎn)化子。但是本系統(tǒng)含PEG Enhancer可以提高連接效率數(shù)倍，在高連接酶量的情況下（10ml體系推薦連接酶量為5 Weiss Units）16℃連接30分鐘即可達一般研究的要求。
3) 冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。
3. 快速連接反應：
1) 反應按以下體系進行：
5ml | 2 ′ Quick Ligation Buffer (用前充分融解混勻) |
1ml | pBLUE-T Simple Vector |
Xml | 純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control |
Yml | 無菌水 |
1ml (5 Weiss Units/ml) | T4 DNA Ligase |
Final Volume | 10ml |
一般最后加入T4 DNA Ligase。
2) 22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。
2 ′Quick Ligation Buffer已經(jīng)包含所有優(yōu)化的快速連接成份，通常推薦22℃連接10分鐘（10ml體系連接酶量為5 Weiss Units，長片段連接可以延長至30分鐘）一般可以得到滿意結(jié)果。此外本系統(tǒng)也可在16℃連接30分鐘（10ml體系連接酶量為5 Weiss Units）即可達一般研究的要求。
3) 冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。
4. 轉(zhuǎn)化：
e 50-100ml感受態(tài)細胞，置于冰上，wan全解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。
e 加入4－5ml連接液(最多可全部加入，只要體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3分鐘。
e 加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘。
e 將200ml細菌涂布在預先用16ml 50mg/ml IPTG和40ml 20 mg/ml X-gal 涂布的氨芐青霉su平板上。
涂布細菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細胞的感受率而進行適當?shù)恼{(diào)整，如果 預計的克隆較少，可通過離心（4,000rpm，2 分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少，可將剩余菌液全部涂一個新培養(yǎng)板)。
e 平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。
5 篩選：
1). 轉(zhuǎn)化子的藍白篩選：
當外源DNA片段插入到pBLUE-T Simple 中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物b-半乳糖苷酶a-片段的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍色。有的時候插入片段沒有影響lacZ 基因讀碼框， 或插入片段太小，這種情況下菌落（重組克?。┏尸F(xiàn)淡藍色或者在菌落中心呈現(xiàn)淡藍斑點，外圈白色（魚眼狀藍斑fish eye）。選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落或者淡藍色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉su的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。
2). 轉(zhuǎn)化子的鑒定：
a. 用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒，用插入片段所帶酶切位點酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。
b. 挑取白色菌落直接進行PCR檢測
c. 用T3啟動子引物或M13通用測序引物測序來確定是否含有目的克隆。
e 如何計算連接反應中需要的PCR產(chǎn)物的量?
一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式：
[加入載體的量（ng）×插入片段大?。╧b）÷載體大?。╧b）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應中加入載體40ng，插入片段大小為1000bp，這時應加入插入片段的量為[40ng載體×1kb插入片段÷2.928kb載體]×3/1=40.1ng。
pBLUE-T Simple載體快速克隆試劑盒 T4原理
